Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Phòng thí nghiệm > Làm thí nghiệm với protein

Làm thí nghiệm với protein Điện di protein, Western blot, Elisa, sắc ký, khối phổ...

Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 19-11-06, 16:43   #1
Bùi Hoàng Phúc
Registered Users
 
Bùi Hoàng Phúc's Avatar
 
Tham gia ngày: Oct 2006
Đến từ: University of Tsukuba, Japan
Bài gửi: 4
Thanks: 1
Thanked 0 Times in 0 Posts
Các bác giúp em trả lời câu hỏi này với:
- Có mấy loại điện di protein?
- Phân biệt giữa 2 điều kiện denature và non-denature trong điện di proten? Khi nào thì sử dụng nó?
Bùi Hoàng Phúc is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn

Sponsored Links
Old 19-11-06, 17:09   #2
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 720 Times in 427 Posts
Theo như tôi được biết có những loại điện di protein như sau:
+Một chiều: SDS-PAGE, Native-PAGE, gradient hoặc không gradient, IEF (bước đầu của điện di 2 chiều)
+Hai chiều
Biến tính là làm protein tan, chỉ còn mạch đơn và thẳng (dùng SDS, mercaptoethanol, Dithiothreitol, urea, diurea...v.v và nói chung không thể hồi tính còn không biến tính là protein có thể biến tính tạm thời để chạy điện di (ví dụ cho pH cao để nó tích điện âm) rồi sau đó hồi tính.
Điện di không biến tính (native-PAGE) thường là để tinh sạch protein hoặc kiểm tra độ sạch, vì protein sau đó có thể thu hồi lại được và đem đi refold.
Điện di biến tính hay dùng để tính trọng lượng phân tử (mặc dù chỉ là tổng của từng tiểu phần)

Mời các bác đóng góp thêm.
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 19-11-06, 17:34   #3
Nguyễn Xuân Hưng
Administrator
 
Nguyễn Xuân Hưng's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Đến từ: Genetics of Drosophila Immune Response, IBMC, University of Strasbourg
Bài gửi: 2,169
Thanks: 307
Thanked 776 Times in 425 Posts
@Phúc: Vì điện di protein có rất nhiều kỹ thuật. Ở trên bác Lương mới đưa ra các kỹ thuật điện di gel thôi.

Ngoài ra còn nhiều kỹ thuật khác nữa. Nói đơn giản thế này: cứ phương pháp nào làm protein di động nhờ điện trường thì gọi là điện di protein. Từ đó có thể suy ra có nhiều phương pháp lắm.

Ví dụ: có thể chia các kiểu điện di theo chất nền (agarose hay acrylamide hay màng cellulose acetate...), theo chiều (điện di 1 chiều, 2 chiều), theo kiểu (điện di đứng, điện di ngang, điện di mao quản...), theo một số phương thức bổ trợ khác (điện di thường, Immunoelectrophoresis, Affinity electrophoresis...), theo điện trường áp dụng (Pulsed field gel electrophoresis hay một chiều điện trường), theo phương thức xử lý mẫu native hay denature).....

Nói chung là rất nhiều. Tùy từng đối tượng sẽ có lựa chọn phù hợp.

Phân biệt giữa 2 điều kiện denature và non-denature trong điện di proten thì bác Lương đã nói. Bạn có thể tự tìm thêm thông tin rồi post lên đây mọi người sẽ góp ý.
Nguyễn Xuân Hưng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 23-11-06, 10:16   #4
Phạm Văn Hậu
Registered Users
 
Phạm Văn Hậu's Avatar
 
Tham gia ngày: Apr 2006
Đến từ: Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên
Bài gửi: 6
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Chào Trung,
- Trong quá trình chạy điện di denature (SDS-PAGE) sẽ dùng ít nhất một trong các chất : SDS hay các chất khử như beta-mercaptoethanol, Dithiothreitol, urea, diurea hoặc các tác nhân gây biến tính khác: nhiệt độ, pH...
- Còn chạy non-denature (NATIVE-PAGE): không dùng các chất trên và tác nhângây biến tính protein.
Dùng chúng khi:
- SDS-PAGE:muốn xác định độ tinh sạch, xác định trọng lượng phân tử, phát hiện số lượng subunit của phân tử protein...
- NATIVE-PAGE : thường dùng để phát hiện được các isomer
Một số ý kiến trao đổi cùng bạn! Mong ý kiến từ các bạn.
pvhau
Phạm Văn Hậu is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 28-03-09, 20:26   #5
duongdikho_mtdkh
Registered Users
 
duongdikho_mtdkh's Avatar
 
Tham gia ngày: Dec 2008
Đến từ: Địa Ngục
Bài gửi: 17
Thanks: 15
Thanked 15 Times in 12 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Phạm Văn Hậu View Post
Chào Trung,
- Trong quá trình chạy điện di denature (SDS-PAGE) sẽ dùng ít nhất một trong các chất : SDS hay các chất khử như beta-mercaptoethanol, Dithiothreitol, urea, diurea hoặc các tác nhân gây biến tính khác: nhiệt độ, pH...
- Còn chạy non-denature (NATIVE-PAGE): không dùng các chất trên và tác nhângây biến tính protein.
Dùng chúng khi:
- SDS-PAGE:muốn xác định độ tinh sạch, xác định trọng lượng phân tử, phát hiện số lượng subunit của phân tử protein...
- NATIVE-PAGE : thường dùng để �phát hiện được các isomer
Một số ý kiến trao đổi cùng bạn! Mong ý kiến từ các bạn.
pvhau
Xin các bác so sánh ưu điểm của điện di biến tính và điện di không biến tính( thời gian, độ chính xác...) hộ em!
Em mới làm về điện di nên không rành lắm! Nhưng theo em hiểu thì nhờ có quá trình biến tính mà các cấu trúc của protein đều chuyển về bậc 1( nhờ SDS, Mecapto Ethanhol, nhiêt độ..) tức là nó ở dạng sợi thẳng, còn nếu như ko biến tính thì nó vẫn có thể ở dạng xoắn. và chính vì cấu trúc dạng xoắn này nó sẽ ảnh hưởng tới quá trình di chuyển của protein trong gel tách! Tức là theo như em hiểu vì có cấu trúc dạng sợi nên nó có thể bám vào các lỗ gel nên cho kết quả ko chính xác lắm! Và em cũng nghĩ rằng với cấu trúc xoắn này thì thời gian điện di cũng sẽ lâu hơn!
Như vậy nếu dùng với mục đích định tính thì điện di biến tính sẽ chính xác hơn điện di ko biến tính( em nghĩ thế)!

Đó là những suy nghĩ của em! Nhưng em thấy điện di ko biến tính vẫn được áp dụng nhiều vì vậy chắc là suy nghĩ của em ko chính xác!
Rất mong các bác cho ý kiên để em sáng tỏ vấn đề!
Nhân thể, em lại xin hỏi thêm 1 vấn đề nữa cũng về điện di: có cách nào làm đậm đặc dịch mẫu của mình để chạy điện di ko vậy. Em có nghe nói tới phương pháp kết tủa bằng aceton, sau đó lắc đều và để ở nhiệt độ thấp trong 15- 20 phút! Sau đó, ly tâm, lấy cắn, và để khô cắn thì thu được tủa. Em cũng ko hiểu lắm! bác nào biết xin chỉ rõ giùm em và giải thích hộ em với!
Em xin chân thành cảm ơn!
duongdikho_mtdkh is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 30-03-09, 19:31   #6
duongdikho_mtdkh
Registered Users
 
duongdikho_mtdkh's Avatar
 
Tham gia ngày: Dec 2008
Đến từ: Địa Ngục
Bài gửi: 17
Thanks: 15
Thanked 15 Times in 12 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi duongdikho_mtdkh View Post
Xin các bác so sánh ưu điểm của điện di biến tính và điện di không biến tính( thời gian, độ chính xác...) hộ em!
Em mới làm về điện di nên không rành lắm! Nhưng theo em hiểu thì nhờ có quá trình biến tính mà các cấu trúc của protein đều chuyển về bậc 1( nhờ SDS, Mecapto Ethanhol, nhiêt độ..) tức là nó ở dạng sợi thẳng, còn nếu như ko biến tính thì nó vẫn có thể ở dạng xoắn. và chính vì cấu trúc dạng xoắn này nó sẽ ảnh hưởng tới quá trình di chuyển của protein trong gel tách! Tức là theo như em hiểu vì có cấu trúc dạng sợi nên nó có thể bám vào các lỗ gel nên cho kết quả ko chính xác lắm! Và em cũng nghĩ rằng với cấu trúc xoắn này thì thời gian điện di cũng sẽ lâu hơn!
Như vậy nếu dùng với mục đích định tính thì điện di biến tính sẽ chính xác hơn điện di ko biến tính( em nghĩ thế)!

Đó là những suy nghĩ của em! Nhưng em thấy điện di ko biến tính vẫn được áp dụng nhiều vì vậy chắc là suy nghĩ của em ko chính xác!
Rất mong các bác cho ý kiên để em sáng tỏ vấn đề!
Nhân thể, em lại xin hỏi thêm 1 vấn đề nữa cũng về điện di: có cách nào làm đậm đặc dịch mẫu của mình để chạy điện di ko vậy. Em có nghe nói tới phương pháp kết tủa bằng aceton, sau đó lắc đều và để ở nhiệt độ thấp trong 15- 20 phút! Sau đó, ly tâm, lấy cắn, và để khô cắn thì thu được tủa. Em cũng ko hiểu lắm! bác nào biết xin chỉ rõ giùm em và giải thích hộ em với!
Em xin chân thành cảm ơn!
Em nghĩ rằng rất nhiều bác đã làm về điện di. Xin các bác cho ý kiến giúp em với!
duongdikho_mtdkh is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 30-03-09, 20:15   #7
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 720 Times in 427 Posts
Tùy không biến tính mức độ nào nữa. Ví dụ để xem protein nó có assemble thành cấu trúc phức như mong muốn không thì chỉ biến tính SDS mà không thêm reducing agent. Còn native gel electrophoresis thì không biến tính hoàn toàn luôn.
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 30-03-09, 22:44   #8
duongdikho_mtdkh
Registered Users
 
duongdikho_mtdkh's Avatar
 
Tham gia ngày: Dec 2008
Đến từ: Địa Ngục
Bài gửi: 17
Thanks: 15
Thanked 15 Times in 12 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Nguyễn Ngọc Lương View Post
Tùy không biến tính mức độ nào nữa. Ví dụ để xem protein nó có assemble thành cấu trúc phức như mong muốn không thì chỉ biến tính SDS mà không thêm reducing agent. Còn native gel electrophoresis thì không biến tính hoàn toàn luôn.
Trước hết, em xin cảm ơn bác Lương!
Sau khi tìm hiểu thêm về điện di thì em hiểu rằng:

Thứ nhất, tác dụng chính của SDS là dãn mạch protein thành mạch thẳng( cấu trúc bậc 1) và làm protein mang điện tích âm đẫn tới protêin chuyển động về phía điện cực dương. Còn tác dụng cắt các cầu disulfit là rất yếu!

Thứ hai, tác dụng chính của các tác nhân khử như mercapto Ethannol, ure,.. nhiệt độ, pH là làm biến tính protein cụ thể là cắt đứt các liên kết disulfua(S-S), liên kết hydro...(chỉ trừ liên kết peptid).

Thế nhưng, sau khi tìm hiểu xong 2 vấn đề trên em lại thắc mắc như sau(lấy 1 ví dụ cụ thể):

Insulin bò(là protein có cấu trúc bậc 1) có cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptid: chuỗi A(21 acid amin) và chuỗi B(30 acid amin), chuỗi B dài hơn chuỗi A, chuỗi A và chuỗi B liên kết với nhau chỉ bằng 2 cầu nối disulfit.


Như vậy, nếu điện di biến tính protein trên thì sau khi biến tính ta sẽ thu được 2 chuỗi riêng biệt A và B do liên kết disulfua bị cắt đứt. Vậy em xin hỏi khi chạy điện di, nhuộm, tẩy ta sẽ thu được mấy vết trên gel(coi như mấu để chạy điện di là sạch và chi có protein trên thôi)

Nếu như theo em hiểu thì trên gel polyacrylamid sẽ có 2 vết gồm 1 vết của chuỗi A và 1 vết của chuỗi B, vết chuỗi A sẽ ở dươi vết B do có trọng lượng nhỏ hơn! Nếu em hiểu như vậy thì lại mâu thuẫn với ý kiến của bác Lương và nhiều sách khác:
Trích:
Nguyên văn bởi Nguyễn Ngọc Lương View Post
Điện di biến tính hay dùng để tính trọng lượng phân tử (mặc dù chỉ là tổng của từng tiểu phần)
Nếu hiểu như em, điện di biến tính là để định tính từng tiểu phân của protein mà ko định tính được protein đó( và cũng không phải là tổng của từng phần)!

Chính vì mâu thuẫn như trên mà em vẫn chưa hiểu rõ về điện di một cách sâu sắc!

Em nghĩ bác Lương và các bác khác đã hiểu câu hỏi của em! Xin bác Lương và các bác khác cho ý kiến để em hiểu được vai trò của quá trình biến tính và quá trình điện di một cách sâu sắc hơn!

Nếu các bác thấy câu hỏi của em có gì khó hiểu xin reply lại cho em để em trình bày được rõ hơn!

Mong các bác góp ý giùm em!
duongdikho_mtdkh is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 31-03-09, 03:32   #9
Nguyễn Xuân Hưng
Administrator
 
Nguyễn Xuân Hưng's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Đến từ: Genetics of Drosophila Immune Response, IBMC, University of Strasbourg
Bài gửi: 2,169
Thanks: 307
Thanked 776 Times in 425 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi duongdikho_mtdkh View Post
Trước hết, em xin cảm ơn bác Lương!
Sau khi tìm hiểu thêm về điện di thì em hiểu rằng:

Thứ nhất, tác dụng chính của SDS là dãn mạch protein thành mạch thẳng( cấu trúc bậc 1) và làm protein mang điện tích âm đẫn tới protêin chuyển động về phía điện cực dương. Còn tác dụng cắt các cầu disulfit là rất yếu!

Thứ hai, tác dụng chính của các tác nhân khử như mercapto Ethannol, ure,.. nhiệt độ, pH là làm biến tính protein cụ thể là cắt đứt các liên kết disulfua(S-S), liên kết hydro...(chỉ trừ liên kết peptid).

Thế nhưng, sau khi tìm hiểu xong 2 vấn đề trên em lại thắc mắc như sau(lấy 1 ví dụ cụ thể):

Insulin bò(là protein có cấu trúc bậc 1) có cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptid: chuỗi A(21 acid amin) và chuỗi B(30 acid amin), chuỗi B dài hơn chuỗi A, chuỗi A và chuỗi B liên kết với nhau chỉ bằng 2 cầu nối disulfit.


Như vậy, nếu điện di biến tính protein trên thì sau khi biến tính ta sẽ thu được 2 chuỗi riêng biệt A và B do liên kết disulfua bị cắt đứt. Vậy em xin hỏi khi chạy điện di, nhuộm, tẩy ta sẽ thu được mấy vết trên gel(coi như mấu để chạy điện di là sạch và chi có protein trên thôi)

Nếu như theo em hiểu thì trên gel polyacrylamid sẽ có 2 vết gồm 1 vết của chuỗi A và 1 vết của chuỗi B, vết chuỗi A sẽ ở dươi vết B do có trọng lượng nhỏ hơn! Nếu em hiểu như vậy thì lại mâu thuẫn với ý kiến của bác Lương và nhiều sách khác:


Nếu hiểu như em, điện di biến tính là để định tính từng tiểu phân của protein mà ko định tính được protein đó( và cũng không phải là tổng của từng phần)!

Chính vì mâu thuẫn như trên mà em vẫn chưa hiểu rõ về điện di một cách sâu sắc!

Em nghĩ bác Lương và các bác khác đã hiểu câu hỏi của em! Xin bác Lương và các bác khác cho ý kiến để em hiểu được vai trò của quá trình biến tính và quá trình điện di một cách sâu sắc hơn!

Nếu các bác thấy câu hỏi của em có gì khó hiểu xin reply lại cho em để em trình bày được rõ hơn!

Mong các bác góp ý giùm em!
Bạn đọc thêm bài này trước khi thảo luận thêm nhé.
http://www.ap-lab.com/native_gels.htm
__________________
Burning on the ice
Nguyễn Xuân Hưng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-03-15, 23:18   #10
MINH CHU
Registered Users
 
MINH CHU's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2015
Bài gửi: 2
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
các bác cho em hỏi
Điện di protein trên gel agarose có thể sử dụng các tác nhân biến nào
Khi biến tính protein thì các band vạch thu được phân biệt nhau bởi cái gì
MINH CHU is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến

Similar Threads
Ðề tài Người gửi Chuyên mục Trả lời Bài mới gởi
Ung thư và protein - Giải thích của dược sĩ VN vl-sinhoc Động vật 32 04-08-16 14:17
Biểu hiện Protein màng trên tế bào thực vật? Ngô Đức Trí Làm thí nghiệm với protein 1 13-07-07 01:27
hỏi về protein Lê Văn Thản Lớp 12: Di truyền - Biến dị 23 28-04-07 10:06
Tế bào sống động vật và cách thức tạo protein Đào Đức Thịnh Hóa sinh 0 03-02-07 16:27
Một câu hỏi về tổng hợp protein Thành viên cũ Hóa sinh 4 29-12-04 09:58


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2018, Jelsoft Enterprises Ltd.