Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Phòng thí nghiệm > Làm thí nghiệm với protein

Làm thí nghiệm với protein Điện di protein, Western blot, Elisa, sắc ký, khối phổ...

Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 14-09-05, 22:54   #11
Trương Quốc Phong
Registered Users
Thread starter
 
Trương Quốc Phong's Avatar
 
Tham gia ngày: May 2005
Đến từ: Khoa Hóa sinh và SHPT, ĐH Bách khoa HN
Bài gửi: 21
Thanks: 0
Thanked 4 Times in 4 Posts
Qua cách xưng hô của Vietbio cho phép em gọi daffodi là chị nhé.
Chị em mình viết bài trên tinh thần xây dựng, trao đổi kinh nghiệm và kiến thức nhé.
l
1.
Trích:
Nguyên văn bởi daffodil
Tôi chả bao giờ nói là tách protein màng dễ và chỉ cần Urea cả.
Em không hiểu ý chị viết ở đây là gì:
Trích:
Nguyên văn bởi daffodil
Không có detergents trong extraction buffer vẫn thu được 1 số protein bám màng. Mà nếu có urea và NaCl thì thừa sức thu được cả những protein liên kết chặt với màng ấy chứ.
Ở đây, Urea là chaotropic agents, chứ không phải là Detergent. Cho nên nếu dùng chỉ Urea không chắc chắn sẽ không tách đựợc protein màng một cách hiệu quả. Cho nên, người ta (em cũng đã dùng) đã phải dùng kết hợp một số chaotropic agents với các Detergents khác thì mới thu đựoc protein màng một cách hiệu quả. Mà vai trò quan trọng ỏ đây là thuộc về Detergent. Vì sao? vì tính chất và cách thức hoạt động của chaotropic agents và detergents (mọi người đều biết rồi ạ).
Ở đây em quan tâm là profile of membrane protein, cho nên cần phải thu được toàn bộ protein màng (nếu có thể). Nếu dùng cách như của chị nói thì cũng có thể vẫn thu được protein màng nhưng chỉ có thể là một vài mà thôi.
Cụ thể: em đã dùng đến cả SB3-10, tất nhiên là cả một số chaotropic agents nữa nhưng theo kết quả phân tích khối phổ em chỉ thu đựợc 1 số protein màng mà thôi. Vì mục đích trong nghiên cứu này không phải là quan tâm đến protein màng nên quy trình tách chiết đã được biến đổi.
Triton X100 (loại khác thì khác) không phải là detergent tối ưu cho tách protein màng. Mà amidosulfobetaine với đuôi kỵ nước dài (ASB-14 và SB 3-10 ) mới là detergent được ưa thích (Lab em đang dùng các loại này). Theo em, nếu ai chuẩn bị làm làm về proteins kỵ nước thì nên tham khảo loại detergent này.

2.
Trích:
Nguyên văn bởi daffodil

Ảnh điện di của Biochemistry là silver staining à? Sao crude extract của bạn ít bands thế.
Đúng ảnh điện di mà em đã post lên là nhuộm bạc. Nó ít băng là đúng thôi thứ nhất là bởi vì mẫu là tim mà; thứ 2, protein mà em quan tâm không phải là low abundant protein. Mức độ abundant của các protein là khác nhau và khác nhau ở các mô khác nhau. Lượng protein em dùng để điện di tương đối ít (tiết kiệm mà). Nên việc nhìn thấy nhiều hay ít chỉ có người làm trực tiếp mới đánh giá chính xác được. Và điều nữa là, ông thầy của em bao giờ ông ấy cũng muốn nhìn original để đánh giá chứ không bao giờ ông ấy nhìn ảnh.

Chị có kinh nghiệm gì thì mách bọn em nhé.
Trương Quốc Phong is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 07-11-05, 00:15   #12
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 720 Times in 427 Posts
Thời đại này để chạy SDS-PAGE thì discontinuous gel được coi là mặc định. Nếu hỏi tại sao thì câu trả lời thường đại khái là để tập trung protein ở đường phân cách để chạy"cùng vạch xuất phát". Không thỏa mãn cách giải thích đó tôi tìm được bài viết sau:
Stacking principles:
When glycine from the upper reservoir enters the low pH 6.8 of the stacking gel, it will principally
be in the neutral zwitterionic form, with only a fraction (1%) in the negative glycinate form. This
prevents glycine from being an effective carrier of current. The Cl- ions remain effective current
carriers at pH 6.8 and migrate rapidly toward the anode. During this electrophoresing in the
stacking gel, the Cl- ion concentration becomes depleted at the cathode end of the gel (top), forming
an increasing concentration gradient toward the anode (bottom). The SDS-coated protein molecules
and the dye, which have charge-to-mass ratios greater than that of the glycine but less than that of
Cl-, must now migrate to carry the electrophoresis current behind the Cl- and ahead of the glycine.
As electrophoresis continues, protein molecules reaching the resolving gel will become greatly
retarded, allowing trailing protein molecules to catch up, ensuring that the volume of the protein
sample "presented" to the resolving gel will be much smaller than the volume of the sample initially
loaded onto the stacking gel. This movement of proteins and dye in the stacking gel also creates an
ion gradient, so that eventually the glycine must carry the current behind the proteins. This has the
effect of concentrating (stacking) the proteins in a thin band sandwiched between the Cl- ions and
the glycine molecules at the interface between the stacking and resolving gels. It should be noted
that for the stacking gel to function properly, it must be at the appropriate pH 6,8 where the
glycine counterion is zwitterionic with only slight anionic character.
When the stacked bands enter the higher pH of the resolving gel, glycine becomes anionic, carrying
a higher charge-to-mass ratio than that of the proteins. Now the newly formed glycinate ions move
faster than the proteins, with mobility approaching that of the Cl- ions. A new concentration
gradient forms, requiring that the proteins and tracking dye carry the current in the trail of the Cland
glycinate ions. The proteins move according to their relative mobilities and are separated by
the sieving effect of the resolving gel according to size. The high mobility of the tracking dye
assures that it will migrate faster than the proteins. When the tracking dye reaches the end of the
gel, the electrophoresis is terminated so that the proteins do not run off the end of the gel.
The extract is copied from:
http://www.che.ilstu.edu/jfriesen/CH...all%202005.pdf
Trước tiên để tiện ai cũng theo dõi được tôi lược dịch đoạn trên:
Trước đây khi chạy SDS-PAGE người ta chỉ chạy trên 1 gel là gel tách (resolving gel). Sau này người ta chạy trên gel gép giữa gel dồn (stacking) và gel tách với kinh nghiệm cho thấy chạy trên gel ghép được độ phân giải cao hơn. Có 2 lý do để sử dụng gel ghép:
- cho độ phân giải cao
- lượng protein đi vào gel bằng với lượng protein tải lên giếng (như vậy so sánh giữa thí nghiệm & đối chứng mới chính xác)
Lý giải cho lý do thứ 2 thì bài viết đã nêu rất rõ: gel dồn xốp hơn gel tách nên nó cho tất cả protein chạy thoải mái cho đến khi gặp gel tách thì lớn nhỏ đều chạy chậm lại, tạo điều kiện cho protein lớn bắt kịp protein nhỏ.
Lý do thứ nhất thì bài viết cũng nêu khá rõ mặc dù khó hình dung hơn: ở pH 6.8 Cl- (có trong đệm chạy điện di) tạo nên dòng điện dịch chuyển từ cathode về anode, kéo theo protein phủ SDS theo. Khi cả Cl- và protein chạy về phía đường ranh giới giữa gel dồn và gel tách thì chúng tạo nên gradient ion, làm cho glycine (có trong đệm chạy điện di) vốn là ion có điện tích tổng cộng bằng 0 cũng bắt đầu dịch chuyển về phía anode. Kết quả protein bị kẹp giữa làn Cl- chạy trước và glycine chạy sau, tạo thành một băng rõ rệt ở đường phân cách 2 gel.
Khi băng protein sau khi đã được dồn lại đi vào gel tách thì glycine ở pH 8.8 trở thành anion và có tỉ lệ tích điện:trọng lượng cao hơn protein nên chạy trước protein. Kết quả là glycine & và Cl- tạo nên động lực (gradient ion) để kéo protein về phía anode. Kết quả protein được tách theo kích thước (do điện tích đã bù trừ cho trọng lượng khi tỉ số điện tích:trọng lượng không đổi)
Hy vọng các bạn sinh viên thỏa mãn được théc méc của mình.
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Thanked by
Old 24-10-10, 20:21   #13
talaai0101
Registered Users
 
talaai0101's Avatar
 
Tham gia ngày: Oct 2010
Bài gửi: 3
Thanks: 0
Thanked 1 Time in 1 Post
Xin cho mình hỏi tác dụng của của các hóa chất trong kĩ thuật điện di SDS-PAGE này như: Tris, ABE, TEMED, Buffer..... Hiện mình đang cần gấp để kiểm tra. Thân.
talaai0101 is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 03-03-13, 13:24   #14
alexkorea
Registered Users
 
alexkorea's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2013
Bài gửi: 2
Thanks: 7
Thanked 0 Times in 0 Posts
Em chào anh Trương Quốc Phong, em là thành viên mới của diễn đàn. Hiện nay, em cũng đang rất quan tâm đến vấn đề này, vậy anh có thể cho em xin file mềm của cuốn Hoefer và cuốn Electrophoresis in Practice không ạ? Em đang rất cần ạ.
Email của em: letuongk61@gmail.com
Em cảm ơn anh nhiều. Mong nhận được hồi âm của anh.
alexkorea is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến

Similar Threads
Ðề tài Người gửi Chuyên mục Trả lời Bài mới gởi
Điện di SDS PAGE protein Đặng Trịnh Minh Anh Làm thí nghiệm với protein 12 19-02-16 17:08
Điện di protein trên SDS-PAGE Nguyễn Ngọc Lương Làm thí nghiệm với protein 7 12-09-05 11:12


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2018, Jelsoft Enterprises Ltd.