Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Phòng thí nghiệm > Làm thí nghiệm với acid nucleic

 
Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 03-09-04, 18:24   #1
Dương Văn Cường
Administrator
 
Dương Văn Cường's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Bài gửi: 1,439
Thanks: 239
Thanked 2,221 Times in 188 Posts
Trích:
Em thấy các anh các chị nói đến việc dùng kit trong chuẩn đoán nhiều thứ, không biết nguyên tắc chế tạo một cái kit như vậy thế nào? Anh chị nào có tài liệu hoặc biết website nào nói về vấn đề làm các loại kit không cho em mượn với, em thấy cái này hay quá.
Hiện giờ tôi mới biết có 2 loại KIT chẩn đoán nhanh. Loại 1 dựa trên phản ứng PCR và loại 2 dựa trên phản ứng Kháng nguyên - Kháng thể.

Nguyên tắc tạo bộ kit loại 1:

+ Bước 1: Nghiên cứu xem để phát hiện một tác nhân gây bệnh nào đó (virus, vi khuẩn ...) thì tốt nhất là phát hiện dựa trên sự có mặt của đoạn acid nucleic nào của tác nhân đó. Thông thường người ta chọn đoạn DNA nằm ở vùng bảo thủ cao của sinh vật. Lưu ý ở đây là phát hiện đinh tính ĐOẠN DNA/RNA nào đó chứ không nhất thiết phải là phát hiện gen nào đó. Đây cũng là bước khó khăn, mất thời gian, tốn tiền nhất của quy trình.
+ Bước 2: Khi đã tìm được đối tượng của phản ứng PCR, dĩ nhiên phải tiến hành làm PCR để xem có tóm cổ được cái đoạn đó không.
+ Bước 3: Sau khi bước 2 thành công, chuẩn hóa quy trình PCR và tối ưu về chi phí.
+ Bước 4: Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA/RNA của đối tượng cần chẩn đoán nhanh (virus, vi khuẩn ...) theo một protocol mà sao cho đối tượng chỉ biết lơ tơ mơ, hoặc thậm chí chẳng biết gì về Sinh học phân tử cũng có thể tách chiết được.
+ Bước 5: Thiết kế, chuẩn bị và đóng gói quy trình, chuyển đến cho khách hàng. Cụ thể là các thành phần của phản ứng PCR (trừ template) được cho sẵn vào các ống eppendoft, thông thường được bổ xung chất bảo quản (BSA) và đem đông khô. Các thành phần và quy trình tách chiết DNA/RNA cũng được bán kèm theo. Người sử dụng phải làm công việc là tách DNA, cho DNA đó và H20 vào ống eppendoft KIT có tất cả các thành phần đó, và chạy PCR.

Cụ thể bệnh gây triệu trứng đốm trắng do virus ở tôm (White Spot Syndrome Virus) sử dụng KIT như thế này để chẩn đoán.


Nguyên tắc tạo bộ KIT dựa trên phản ứng Kháng nguyên - Kháng thể phức tạp hơn nhiều. Mấy ngày nữa tôi sẽ post lên. (tìm hiểu kỹ hơn đã )
Dương Văn Cường is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 05-09-04, 09:59   #2
Dương Văn Cường
Administrator
Thread starter
 
Dương Văn Cường's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Bài gửi: 1,439
Thanks: 239
Thanked 2,221 Times in 188 Posts
Trích:
1. Cách thức để bắt được những VSV như thế nào? ví dụ như với môi trường không khí số lượng VSV rất ít.
Tôi chưa hiểu câu hỏi này liên quan cụ thể với việc chế tạo bộ KIT như thế nào.
Theo ý hiểu của tôi về việc chế tạo bộ KIT thì việc "bắt" được các VSV là không cân thiết. Lý do:
- Trong giai đoạn nghiên cứu lý thuyết (Bước 1 và 2) thì các chủng VSV gây bệnh thường được cung câp bởi các ngân hàng VSV. (Việc các ngân hàng VSV đó bắt được VSV như thế nào thì là cả câu chuyện dài, nên tách biệt khỏi chủ đề về KIT)
- Trong giai đoạn sau, ứng dụng vào thực tiễn, thì mục đích của bộ KIT cũng không phải là tóm được VSV mà là tóm được cái đoạn DNA của VSV đó trong cơ thể của sinh vât bị gây bệnh.

Trích:
2. Với các bào tử thì KIT trên có dùng dược không?
Tôi quên mât bào tử nó như thế nào rồi :( , . Nhưng chúng ta có thể hiểu nguyên tắc của bộ kit là ĐỊNH TÍNH sự có mặt hay không của tác nhân gây bệnh trong cơ thể của sinh vât cân kiểm tra. Do đó nếu bào tử gây bệnh tồn tại trong cơ thể của SV bị bệnh, và các nghiên cứu có thể tách chiêt được DNA tổng số của cả vât chủ và vât gây bệnh, thì về mặt lý thuyết không có lý do gì không áp dụng được. Khó khăn nếu có chắc chỉ nằm ở khâu tách DNA.
Dương Văn Cường is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 13-09-04, 20:40   #3
Thành viên cũ
Registered Users
 
Thành viên cũ's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Bài gửi: 466
Thanks: 0
Thanked 9 Times in 7 Posts
He , góp ý 1 chút .... hình như "Bào tử" là vsv sống ở dạng tiềm sinh ...cho nên theo mình 99% là nó ko phải là tác nhân gây bệnh nên có lẽ ko có cơ may tách được đoạn DNA quy định tác nhân :? .
Thành viên cũ is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 30-10-04, 12:41   #4
VanKiemsau
Registered Users
 
VanKiemsau's Avatar
 
Tham gia ngày: Oct 2004
Bài gửi: 19
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
bài quy trình thiết kế các bộ kit chuẩn đoán sử dụng PCR của anh Don'tcry rất hay

to addtech: khi thiết kế các bộ kit thì các nhà khoa học đã phải tính đến tất cả các yếu tố rồi (nếu đối tượng của bạn là vi khuẩn sống trong không khí thì bô kit se co phần thu thập mẫu vi khẩn trong không khí. Các bộ kit khi được thiết kế và bán trên thị trường đều kèm theo phần hướng dẫn sử dụng, bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn sử dụng là co ket quả mong muốn ngay.

đối với bào tử thì DNA của nó được bao bọc trong lớp vỏ khá kiên cố. Tuy nhiên các kit thiết kế cho đối tượng này lại có các chất làm tan lớp vỏ này khá hiệu quả và như vậy là DNA của bào tử đã sẵn sàng cho phản ứng PCR phải không.
VanKiemsau is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 17-03-05, 19:38   #5
Homosapiens
Registered Users
 
Homosapiens's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2005
Bài gửi: 18
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Xin chào các bạn, mình là một thành viên mới của diễn đàn.
Mình đồng ý với bạn Vankiemsau. Bào tử vẫn có DNA hoặc RNA do đó PCR vẫn có thể khuyếch đại DNA/ cDNA này lên chứ ! Còn về chuyệnVSV trong không khí theo mình vấn đề này hoàn toàn không có ý nghĩa (hay mình chưa hiểu ?) bởi vì nguồn mẫu ban đầu để tách chiết nucleic acid cho PCR đều rất cụ thể như mẫu bệnh phẩm, mẫu thực phẩm, mẫu sinh thiết...
Theo mình việc xây dựng nên một bộ kit để chẩn đoán các tác nhân gây bệnh ở người, ĐV, TV hay chẩn đoán bệnh di truyền... bằng kỹ thuật PCR cũng không khó lắm!
À, theo mình PCR chỉ là một phần của một bộ kit thôi.
Homosapiens is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-04-05, 16:32   #6
Nguyễn Thị Phương Trang
Registered Users
 
Nguyễn Thị Phương Trang's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2005
Đến từ: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, VAST
Bài gửi: 48
Thanks: 0
Thanked 4 Times in 3 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi dontcry
Trích:
Em thấy các anh các chị nói đến việc dùng kit trong chuẩn đoán nhiều thứ, không biết nguyên tắc chế tạo một cái kit như vậy thế nào? Anh chị nào có tài liệu hoặc biết website nào nói về vấn đề làm các loại kit không cho em mượn với, em thấy cái này hay quá.
Hiện giờ tôi mới biết có 2 loại KIT chẩn đoán nhanh. Loại 1 dựa trên phản ứng PCR và loại 2 dựa trên phản ứng Kháng nguyên - Kháng thể.

Nguyên tắc tạo bộ kit loại 1:

+ Bước 1: Nghiên cứu xem để phát hiện một tác nhân gây bệnh nào đó (virus, vi khuẩn ...) thì tốt nhất là phát hiện dựa trên sự có mặt của đoạn acid nucleic nào của tác nhân đó. Thông thường người ta chọn đoạn DNA nằm ở vùng bảo thủ cao của sinh vật. Lưu ý ở đây là phát hiện đinh tính ĐOẠN DNA/RNA nào đó chứ không nhất thiết phải là phát hiện gen nào đó. Đây cũng là bước khó khăn, mất thời gian, tốn tiền nhất của quy trình.
+ Bước 2: Khi đã tìm được đối tượng của phản ứng PCR, dĩ nhiên phải tiến hành làm PCR để xem có tóm cổ được cái đoạn đó không.
+ Bước 3: Sau khi bước 2 thành công, chuẩn hóa quy trình PCR và tối ưu về chi phí.
+ Bước 4: Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA/RNA của đối tượng cần chẩn đoán nhanh (virus, vi khuẩn ...) theo một protocol mà sao cho đối tượng chỉ biết lơ tơ mơ, hoặc thậm chí chẳng biết gì về Sinh học phân tử cũng có thể tách chiết được.
+ Bước 5: Thiết kế, chuẩn bị và đóng gói quy trình, chuyển đến cho khách hàng. Cụ thể là các thành phần của phản ứng PCR (trừ template) được cho sẵn vào các ống eppendoft, thông thường được bổ xung chất bảo quản (BSA) và đem đông khô. Các thành phần và quy trình tách chiết DNA/RNA cũng được bán kèm theo. Người sử dụng phải làm công việc là tách DNA, cho DNA đó và H20 vào ống eppendoft KIT có tất cả các thành phần đó, và chạy PCR.

Cụ thể bệnh gây triệu trứng đốm trắng do virus ở tôm (White Spot Syndrome Virus) sử dụng KIT như thế này để chẩn đoán.


Nguyên tắc tạo bộ KIT dựa trên phản ứng Kháng nguyên - Kháng thể phức tạp hơn nhiều. Mấy ngày nữa tôi sẽ post lên. (tìm hiểu kỹ hơn đã )
Lạ thật, đã gọi là Kit chẩn đoán thì có nghĩa là phải dùng với những đối tượng mà bị nghi ngờ là có thể nhiễm bệnh, chứ có phải là tìm vi khuẩn hay virus ở đâu đâu mà hỏi là trong không khí hay gì.
Bào tử là dạng sống tiềm sinh, trong điều kiện môi trường không thuận lợi hoặc phải sống ngoài host cell (vi rút) thì chúng mới phải tạo bào tử, chứ còn trong cơ thể sinh vật (host cell) nghã là điều kiện sống tốt như thế thì sao chúng phải tạo bào tử, hơn nữa bào tử chẳng có khả năng gây bệnh gì cả.
Nhưng mà ở bước 4, tớ không hiểu tại sao phải chuẩn hóa qui trình tách chiết DNA. Tạo bộ Kit là để dùng cho người bệnh, nếu họ nghi ngờ bị nhiễm bệnh thì dùng Kit để kiểm tra xem mình có bị bệnh hay không, thế thôi. Chứ giả sử khi biết mình bị bệnh rồi thì họ phải đến bệnh viện hoặc gì khác chứ họ tự tách DNA của vi rút đấy ra làm gì? (cái này tớ chẳng hiểu).

Còn phản ứng háng nguyên kháng thể thì không cần phải dựa vào DNA (vật liệu DT) mà dùng protein để kiểm tra. Vi dụ nếu bệnh nhân bị nhiễm 1 vi rút gây bệnh nào đó thì cơ thể sẽ tiết ra kháng sinh để chống lại con vi rút đó. Do vậy dựa vào sự có mặt của kháng nguyên này thì người ta sẽ kết luận được là đối tựơng đó có bị nhiễm bệnh hay không.
Nguyễn Thị Phương Trang is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-04-05, 17:55   #7
Dương Văn Cường
Administrator
Thread starter
 
Dương Văn Cường's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Bài gửi: 1,439
Thanks: 239
Thanked 2,221 Times in 188 Posts
Trích:
Nhưng mà ở bước 4, tớ không hiểu tại sao phải chuẩn hóa qui trình tách chiết DNA. Tạo bộ Kit là để dùng cho người bệnh, nếu họ nghi ngờ bị nhiễm bệnh thì dùng Kit để kiểm tra xem mình có bị bệnh hay không, thế thôi. Chứ giả sử khi biết mình bị bệnh rồi thì họ phải đến bệnh viện hoặc gì khác chứ họ tự tách DNA của vi rút đấy ra làm gì? (cái này tớ chẳng hiểu).
Thắc mắc cực kỳ ngộ nghĩnh :D

Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA là để cho những người làm công tác xét nghiệm (bệnh viện, phòng khám, trạm xá ...) họ tách DNA của người bệnh, chứ làm gì có chuyện người bệnh tách DNA của virus, vi khuẩn.
Dương Văn Cường is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-04-05, 18:14   #8
Nguyễn Thị Phương Trang
Registered Users
 
Nguyễn Thị Phương Trang's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2005
Đến từ: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, VAST
Bài gửi: 48
Thanks: 0
Thanked 4 Times in 3 Posts
Tách chiết DNA và dùng PCR để phát hiện ra sự có mặt của 1 đoạn DNA của vi rút là 2 cái khác nhau, dontcry có nhầm không?
Ví dụ cụ thể khi đối tượng bị nghi ngờ là nhiễm bệnh thì sẽ đến bệnh viện để kiểm tra, bác sỹ sẽ lấy mẫu máu của đối tượng và chạy PCR để kiểm tra (sử dụng những hóa chất và primer có sắn trong Kit), nếu kết quả là amplify được đoạn DNA của vi rút thì có nghĩa là đới tượng đã bị nhiễm vi rút đó. Khi đã kết luận được là đối tượng bị nhiễm bệnh thì bác sỹ sẽ sử dụng những liệu pháp hoặc thuốc thích hợp để chữa bệnh, thế thôi.
Cho nên tớ mới thắc mắc cần tách chiết DNA của vi rút để làm gì?, cái này chỉ dể dành cho các nhà khoa học nghiên cứu đặc tính hay cấu trúc... của DNA vi rút đó mà thôi.
Đính chính lại bài post trước là cơ thể sẽ sản xuất ra kháng thể (chứ không phải là kháng sinh, đánh nhầm).
Cái khó nhất của phương pháp tạo Kit bằng PCR là phải thiết kết được cặp mồi đặc hiệu cho từng loại vi rút khác nhau (đặc biệt những vi rút có quan hệ càng gần gũi thì DNA càng giống nhau).
Còn trong phương pháp tạo kit bằng phản ứng miễn dịch thì khó nhất là phải tạo đựơc kháng thể đơn dòng đặc hiệu, chỉ tạo liên kết với đúng loại protein cần quan tâm
Nguyễn Thị Phương Trang is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-04-05, 18:28   #9
Dương Văn Cường
Administrator
Thread starter
 
Dương Văn Cường's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Bài gửi: 1,439
Thanks: 239
Thanked 2,221 Times in 188 Posts
Trích:
+ Bước 4: Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA/RNA của đối tượng cần chẩn đoán nhanh (virus, vi khuẩn ...) theo một protocol mà sao cho đối tượng chỉ biết lơ tơ mơ, hoặc thậm chí chẳng biết gì về Sinh học phân tử cũng có thể tách chiết được.
Ờ đúng rồi, tớ viết sai (chả hiểu sao lại viết thế).

Tách DNA của người bệnh chứ không phải tách DNA của virut vi khuẩn gì cả.

Sắp thành nhà khoa học rùi Sorry bà con và cảm ơn meomeo.

Meo meo này, cậu đã làm thực nghiệm có liên quan đến cái kít kiếc nào chưa ?
Dương Văn Cường is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 19-05-05, 23:33   #10
Trương Quốc Phong
Registered Users
 
Trương Quốc Phong's Avatar
 
Tham gia ngày: May 2005
Đến từ: Khoa Hóa sinh và SHPT, ĐH Bách khoa HN
Bài gửi: 21
Thanks: 0
Thanked 3 Times in 3 Posts
Toi thi nghi rang ban Dontcry cung khong nham dau:
Thuc chat thi chung ta can phai tach ADN cua doi tuong gay benh thi moi lam duoc phan ung PCR chu, nhung co mot van de ma cac ban can hieu ro do la: doi tuong gay benh sau khi xam nhap vao co the vat chu thi no cu tru o dau? no cu tru o plasma hay trong te bao. Chang han khi vi rut sam nhap vao te bao nguoi thi ta phai tach ADN tu te bao nguoi nhung ''khong han'' da phai su dung ADN nguoi lam khuon cho PCR tru truong hop Vi rut do da xen ADN cua no vao he gen cua nguoi. Toi da tung lam thi nghiem chan doan mot so vi rut roi vi du: HBV, HCV, vi rut dom trang o tom. Toi da phai su dung biospy de tach ADN cua chung ma.
Co gi cac ban cung gop y nhe.
Trương Quốc Phong is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến

Similar Threads
Ðề tài Người gửi Chuyên mục Trả lời Bài mới gởi
Nguyên nhân và cơ chế tiến hoá (12 câu) Huỳnh Như Ngọc Hiển Lớp 12: Tiến hóa 6 16-03-13 14:18
Nguyên lý tạo vắc xin Hoàng Đức Minh Miễn dịch 43 20-12-07 16:10
Cho em hỏi về nhưng nguyên nhân gây hỏng rượu ! Phạm Ngọc Dương Công nghệ Vi sinh 8 27-06-06 19:52
Chúc mừng Nguyễn Hữu Hoàng !!! Đào Anh Phúc Thảo luận chung 5 18-03-06 07:26
Chúc mừng Nguyễn Hữu Hoàng Trần Hoàng Dũng Thảo luận chung 3 21-12-05 22:08


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2014, Jelsoft Enterprises Ltd.