TINH CHẾ PROTEIN LAI TÁI TỔ HỢP GNRH-TBK Ở E. COLI
Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi
Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
GnRH-TBK là một “độc tố miễn dịch” tái tổ hợp (Recombinant Immunotoxin-IT) được tạo ra nhờ sự kết hợp giữa thành phần hướng đích là hormon giải phóng kích dục tố (Gonadotropin Reseasing Hormon-GnRH) và thành phần độc tố là một protein bất hoạt ribosome lớp 1 Trichobakin[1, 2], nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các dòng tế bào bộc lộ GnRH receptor bề mặt đặc hiệu.
TBK được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan, có hoạt tính N-glycosidase, có khả năng nhận biết và phân cắt đặc hiệu gốc adenin ở vị trí 4324 của ARN ribosome 28S dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein và gây chết tế bào [3, 4]. GnRH là một neuro-decapeptid, có ái lực cao (Kd khoảng 10-9 M) với các GnRH receptor (GnRHR) và không gây đáp ứng miễn dịch. GnRHR đã được phát hiện thấy nhiều trên bề mặt tế bào thuộc các mô ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến tuỵ[5-9]. Hơn nữa GnRH cũng đã được sử dụng làm thành phần hướng đích trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp như recombinant GnRH-PAP fusion toxin. Trong đó PAP là cũng là một protein bất hoạt ribosome được tách chiết từ cây Phytolacca americana. GnRH-PAP đã có khả năng ức chế đặc hiệu một số dòng tế bào ung thư có biểu hiện các GnRHR bề mặt[5].
Tiếp nối những nghiên cứu về thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK ở E.coli [1], trong bài này chúng tôi giới thiệu về các điều kiện biểu hiện và kết quả tinh chế loại protein tái tổ hợp này.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
Vector biểu hiện pGnRH-TBK mang gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK được thiết kế tại Phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội [1]. Để nghiên cứu biểu hiện có sử dụng tế bào E. coli chủng BL21(DE3), môi trường Luria-Bertani(LB), isopropylthio-b-D-galactoside(IPTG), ampicillin và các hoá chất thông thường khác.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Điện di SDS-PAGE
Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli [12].
2.2.2 Sắc kí trao đổi ion trên hệ FPLC
Sau khi biểu hiện, sinh khối tế bào được thu lại và phá bằng siêu âm trong đệm 50 mM Tris-HCL pH 7,0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme 100mg/ml. Huyền dich tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12 000 vòng/phút trong 20 phút, để tách riêng phần cặn và nổi. Phần nổi được nạp thẳng vào cột CM- Sepharose(XK- 16/20). Protein mang điện tích trái dấu sẽ được giữ trên cột, còn các protein khác bị rửa trôi khỏi cột bằng đệm Tris-HCL pH 7,0. Cột được tiếp tục rửa cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Mẫu được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl nhờ chương trình phần mềm trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech).
2.2.3 Western blotting và phân tích trình tự đầu N của protein tái tổ hợp
Các phương pháp Western blotting và xác định trình tự các axit amin đầu N theo nguyên lý Edman được tiến hành như đã mô tả [13]
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của GnRH-TBK
Tế bào E. coli chủng BL21(DE3) chứa vector biểu hiện pGnRH-TBK đã được chứng minh có biểu hiện GnRH-TBK ổn định [1], tiếp tục được sử dụng làm đối tượng trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, GnRH-TBK là protein lạ đối với tế bào chủ (E .coli), nên GnRH-TBK được biểu hiện ra chủ yếu ở dạng không tan (inclusion bodies). Do vậy để có thể thu được GnRH-TBK ở dạng tan đồng thời xây dựng quy trình tinh sạch GnRH-TBK, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc xác định điều kiện biểu hiện thích hợp là hết sức cần thiết. Trong phạm vi nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự biểu hiện của GnRH-TBK ở dạng tan. Sự biểu hiện của GnRH-TBK được tiến hành khảo sát ở 22oC, 30oC và 37oC. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng trong các bình tam giác giống nhau, lắc 200 vòng/phút ở 37oC, cho đến khi A600 nm đạt 0.4-0.6. Cảm ứng bằng IPTG (nồng độ cuối 0.4 mM) và tiếp tục lắc 200 vòng/phút ở 22oC, 30oC và 37oC. Sinh khối tế bào ở các thời điểm khác nhau 1, 2, 3, 4 giờ và qua đêm(16 giờ) được thu lại bằng ly tâm ở 5000 vòng/phút và phá bằng siêu âm trong đệm như đã mô tả ở trên. Huyền dịch tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12000 vòng/phút, trong 20 phút để tách riêng các phần cặn và nổi. Protein tổng số thu được ở phần nổi và cặn được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. Từ kết quả thu được cho thấy, ở 22oC và sau16 giờ được cảm ứng protein GnRH-TBK được tạo ra tập trung chủ yếu ở dạng tan. Nhưng cùng thời gian trên ở 30oC và 37oC, protein GnRH-TBK lại được biểu hiện ra chủ yếu ở dạng không tan.
3.2 Tinh chế protein GnRH-TBK tái tổ hợp
Để phục vụ cho tinh chế và những nghiên cứu tiếp theo, quá trình biểu hiện protein GnRH-TBK được tiến hành ở 22oC qua đêm (16 giờ). Sinh khối các tế bào vi khuẩn BL21(DE3) được xử lý như đã mô tả ở phần phương pháp. Phần nổi sau ly tâm được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia- Biotech). Các tạp chất được rửa bằng đệm 50 mM Tris-HCl pH 7, 0 cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Immunotoxin tái tổ hợp GnRH-TBK được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7,0 với tốc độ dòng chảy 60 ml/giờ và kích thước mỗi phân đoạn là 1 ml.
Hình 1: Tinh chế protein lai GnRH-TBK.
A: Phổ sắc ký tinh chế GnRH-TBK qua cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech); B: Điện di SDS-PAGE các phân đoạn protein thu được; M: Thang protein chuẩn; 1 - 12: Các phân đoạn ở đỉnh phổ; WB: Western blot với huyết thanh thỏ kháng TBK
Trên hình 1A là phổ sắc ký đặc hiệu cho mẫu thu được từ 500 ml dịch nuôi cấy. Trên phổ có một đỉnh hấp thụ duy nhất đặc trưng cho protein lai GnRH-TBK. Kiểm tra các phân đoạn ở đỉnh của phổ sắc ký bằng SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. Kết quả thu được ở hình 1B cho thấy, mỗi phân đoạn chỉ xuất hiện 1 băng protein duy nhất, có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết của GnRH-TBK là 30 kDa. Như vậy các phân đoạn protein ở đỉnh chứa hoàn toàn là GnRH-TBK và có độ tinh sạch cao. Kết quả Western blotting, các phân đoạn ở đỉnh cho phản ứng đặc hiệu với huyết thanh thỏ kháng TBK. Kết quả phân tích trình tự axit amin đầu N của GnRH-TBK tinh sạch cho thấy, ngoại trừ axit amin đầu tiên của protein tái tổ hợp là Meth, các axit amin tiếp theo là Glu, His, Trp, Ser, Tyr, Gly, Leu… Trình tự này cùng với kết quả Western blotting khẳng định protein thu được chính là protein lai GnRH-TBK.
KẾT LUẬN
Immunotoxin tái tổ hợp GnRH-TBK đã được biểu hiện ở mức khá cao trong E. coli chủng BL21(DE3) nhưng khác nhau ở các điều kiện thay đổi từ 22oC đến 37oC. Sau các bước sử lý đơn giản, GnRH-TBK dạng hoà tan có thể được tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion qua CM-Sepharose trên hệ FPLC.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi (2003) // Di truyền và ứng dụng (đang in)
2. Phan Văn Chi (2001) //Hội thảo Sinh học Quốc tế 2001, Hà nội, tr. 66-68.
3. Phan Văn Chi, Hoàng Quốc Trường, Nguyễn Thuý Hà, Phạm Công Hoạt, Lê Trần Bình (2000) // Những vấn đề cơ bản trong sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 23-28.
4. Phan Van Chi, Hoang Quoc Truong, Nguyen Thuy Ha, Won-II Chung and Le Tran Binh (2001) // Biotechnol. Appl. Biochem. 34: 85-92
5. Jean-Luc Schlick, Philippe Dulieu, Bénédicte Desvoyes, Pascale Adami, Jean Radom, Michéle Jouvenot// FEBS Letters 472 (2000) 241-246.
6. Emos, G., Schrõder, B., Ortmann, O., Westphalen, S., Schultz, K.D. and Schally, A.V. (1993)//J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1458-1464.
7. Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K. and Waxman, J. (1990) // Br. J. Cancer 62, 96-99.
8. Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T. and Tamaya, T. (1994) // Cancer 74, 2555-2561.
9. Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E. and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060.
10. Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno, T., and Tamaya, T., (1997) // Eur. J. Obstet, Gynecol. Report. Biol.74, 73-78.
11. Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and Tamaya, T. (1997) // Int. J. Oncol. 13, 97-100.
12. Laemmli, U. K. (1970) // Nature, 227:680-685.
13. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.
SUMMARY
Purification of recombinant fusion protein GnRH-TBK in E. coli
Đang Thanh Nam, Phan Văn Chi
Institute of Biotechnology, NCST, Hanoi
Immunotoxins constitute a new modality for the treatment of cancer, since they target cells displaying specific surface-receptors or antigens. Immunotoxins contain a ligand such as a growth factor, monoclonal antibody or fragment of an antibody which is connected to a protein toxin. Toxins reviewed here include catalytic proteins produced by plants or bacteria which kill target cells (ricin, PAP or PE, DT…). Recently, we have isolated trichobakin (TBK), a type 1 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98 (Cucurbitaceae family) which reveals antiviral and anticancer activity once inside the cytoplasm. TBK was proved to be a good candidate for the construction of different fusion proteins as recombinant “immunotoxins”. A bacterial expression plasmid encoding TBK as a fusion protein with gonadotropin-releasing hormone (GnRH), a neuro-decapeptide with receptor sites on several gynaecologic tumors has been constructed. The fusion cDNA were amplified by PCR using specific primers designed from the DNA sequences of gnrh, linker and tbk genes and inserted into pET-21d(+) expression vector. This paper represents the results of the expression of the recombinant fusion protein GnRH-TBK in E. coli strain BL21 (DE3). The expression of the protein was assessed by analysis of total protein by SDS-PAGE. It was shown that at 22oC, GnRH-TBK was expressed mainly in soluble form, while at 30oC or 37oC the protein was expressed in both soluble form and inclusion bodies. The recombinant proteins was purified to homogeneity by CM-Sepharose chromatography on FPLC System. The protein has the molecular mass of about 30 kDa and the specific immunoreactivity with antibodies against TBK as it was shown by SDS-PAGE and Western blotting. The specific activity/toxicity of the purified recombinant immunotoxin is under study.
Người thẩm định nội dung khoa học: Ts. Nguyễn Bích Nhi.
Ngày đăng: 06/04/2005
Đã đọc: 2338 lần |
